更新時(shí)間:2024-08-07
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鑒定DNA結(jié)合的蛋白-DNA Pull Down技術(shù)服務(wù)
鑒定DNA結(jié)合的蛋白-DNA Pull Down技術(shù)服務(wù)
常見問題:
Q1:DNA Pull Down的原理是什么?
A:DNA Pull Down是根據(jù)啟動(dòng)子區(qū)域,設(shè)計(jì)DNA探針并進(jìn)行標(biāo)記,標(biāo)記的探針結(jié)合到鏈霉親和素修飾的磁珠上,形成磁珠-探針復(fù)合體。將磁珠-探針復(fù)合體與提取的蛋白孵育,鑒定與DNA探針有特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。
Q2:探針的設(shè)計(jì)原則是什么,長度為多少個(gè)堿基比較合適?
A:啟動(dòng)子的長度一般為100-1000 bp,我們建議選擇起始密碼子上游1000 bp的序列,根據(jù)這1000 bp的序列,來設(shè)計(jì)DNA探針。我們建議探針長度在100 bp-500 bp之間,如果探針序列太短,會(huì)降低與蛋白的親和能力;反之,如果探針序列太長,則會(huì)增加非特異性結(jié)合。
Q3:做DNA Pull Down的探針,用單鏈好還是用雙鏈好?
A:轉(zhuǎn)錄因子是與啟動(dòng)子區(qū)特定的motif結(jié)合,DNA雙鏈的正義鏈和反義鏈上都可能會(huì)有轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合依賴于氫鍵和范德華力,雙鏈DNA能夠增加轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合能力。
Q4:一般會(huì)找到多少個(gè)轉(zhuǎn)錄因子,成功率是多少,有沒有成功的案例?
A:由于DNA Pull Down的特異性強(qiáng),假陽性率低,根據(jù)我們的實(shí)際經(jīng)驗(yàn),一條DNA探針能夠結(jié)合1-6個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。我們目前所做的項(xiàng)目,成功率為80%。我們鑒定出了作物、花卉和木本植物的WRKY、MYB、HD-ZIP、MADS、HSF等轉(zhuǎn)錄因子。
Q5:本實(shí)驗(yàn)的難點(diǎn)在哪里,影響DNA Dull Down實(shí)驗(yàn)的因素有哪些?
A:由于樣本的種類多種多樣,轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)豐度低,本實(shí)驗(yàn)的難點(diǎn)在于樣本細(xì)胞核的分離、細(xì)胞核蛋白的提取。影響DNA Dull Down實(shí)驗(yàn)的因素主要有蛋白的表達(dá)豐度、蛋白和DNA結(jié)合的強(qiáng)弱程度等。
Q6:SDS PAGE之后,為什么用銀染,而不是考染?
A:由于提取或洗脫的蛋白豐度低,所以使用銀染進(jìn)行SDS PAGE后的染色,銀染檢測(cè)靈敏度高,能夠檢測(cè)到ng級(jí)的蛋白質(zhì)。通過銀染,也能夠判斷蛋白提取的質(zhì)量,以及Pull Down之后蛋白洗脫的效果。
Q7:為什么實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組也能夠鑒定出蛋白?
A:如果物種蛋白數(shù)據(jù)庫完整度低、肽段注釋質(zhì)量差,則需要進(jìn)行全庫搜索。全庫搜索,對(duì)于負(fù)對(duì)照和實(shí)驗(yàn)組來說,往往有非特異性蛋白或肽段。這是因?yàn)橛幸恍┑鞍啄軌蚺c磁珠非特異性結(jié)合;另外,配制實(shí)驗(yàn)緩沖液所用的原料試劑、在實(shí)驗(yàn)過程中會(huì)有外部環(huán)境蛋白的污染,比如人的角蛋白污染。由于質(zhì)譜鑒定的靈敏度很高,即使有痕量的蛋白污染,也會(huì)被檢測(cè)出來。
Q8:后續(xù)的驗(yàn)證可以選擇哪些實(shí)驗(yàn)?
A:后續(xù)可以使用酵母單雜交、EMSA、LUC等實(shí)驗(yàn)做進(jìn)一步驗(yàn)證。