體細(xì)胞胚胎發(fā)生(Somatic embryogenesis, SE)可以不經(jīng)過配子融合,由體細(xì)胞分化發(fā)育成整個(gè)植株。SE是一個(gè)多因素的發(fā)育過程,也是研究細(xì)胞全能性的理想模型。目前,SE在多個(gè)領(lǐng)域得到了應(yīng)用,例如:種質(zhì)保護(hù)、人工種子生產(chǎn)、單倍體育種、無性繁殖,以及作為植物生物技術(shù)研究領(lǐng)域的平臺工具。然而,目前對SE調(diào)控機(jī)制的理解僅限于少數(shù)模式植物(例如:擬南芥),而且不同物種之間SE調(diào)控機(jī)制存在很大差異。因此,深入研究重要經(jīng)濟(jì)作物棉花的SE調(diào)控機(jī)制對棉花育種和繁殖具有重要的意義。
2023年7月11日,鄭州大學(xué)與中棉所棉花生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的研究成果發(fā)表在New Phytologist(IF=9.4,Q1區(qū))期刊上,題目為“GhRCD1 regulates cotton somatic embryogenesis by modulating the GhMYC3-GhMYB44-GhLBD18 transcriptional cascade"。該研究使用DNA親和純化測序(DAP-seq)技術(shù)鑒定了陸地棉GhMYC3的結(jié)合基序和靶基因。揭示了GhRCD1-GhMYC3-GhMYB44-GhLBD18轉(zhuǎn)錄級聯(lián)調(diào)控棉花SE的分子機(jī)制,為細(xì)胞全能性以及棉花基因工程研究提供了新思路。
1. GhMYC3是棉花SE過程中一個(gè)重要的調(diào)控因子
通過序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析,在陸地棉中篩選到一個(gè)與Homo-MYC具有高度系統(tǒng)發(fā)育相似性的同源基因GhMYC3,具有1個(gè)bHLH和1個(gè)bHLH-MYC_N結(jié)構(gòu)域。于是假設(shè)GhMYC3在決定細(xì)胞命運(yùn)方面具有與人類MYC相似的生理功能。
為研究GhMYC3對SE過程中細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變的影響,構(gòu)建了過表達(dá)GhMYC3的棉花轉(zhuǎn)基因系(OE-GhMYC3)。表型分析發(fā)現(xiàn)過表達(dá)GhMYC3顯著誘導(dǎo)了SE,促進(jìn)愈傷組織生長。隨后,GhMYC3的RNAi細(xì)胞系(Ri-MYC3)表型分析發(fā)現(xiàn)Ri-GhMYC3與WT的愈傷組織形成率一致,但新鮮愈傷組織的重量(FW)略輕,胚性愈傷組織(EC)分化率顯著降低。以上結(jié)果表明,GhMYC3促進(jìn)棉花體細(xì)胞向愈傷組織的去分化,但阻止了向EC的轉(zhuǎn)變過程。
GhMYC3調(diào)控棉花SE過程
(a) 智人、陸地棉、擬南芥中MYC蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析。(b) 棉花SE過程示意圖。下胚軸作為外植體,用愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng),體細(xì)胞去分化形成愈傷組織,在60-90天的生長過程中,增殖的愈傷組織重新分化為EC,EC發(fā)育成體細(xì)胞胚,而后在體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上萌發(fā)為幼苗。(c) WT、OE-GhMYC3、Ri-GhMYC3在EC分化過程中的形態(tài)差異。(d) 長日照下生長的WT、OE-GhMYC3、Ri-GhMYC3植株葉片組織中GhMYC3的相對表達(dá)量。(e) WT、OE-GhMYC3、Ri-GhMYC3愈傷組織的FW。(f) WT、OE-GhMYC3、Ri-GhMYC3的EC分化率。
2. GhMYC3直接與GhMYB44和GhLBD18的啟動子結(jié)合,調(diào)控其表達(dá)
DAP-seq分析鑒定了GhMYC3的DNA結(jié)合基序及其下游靶基因。鑒于愈傷組織形成和根系生長具有共同的調(diào)控途徑,作者鑒定到了與根系發(fā)育和生長素信號通路有關(guān)的2個(gè)靶基因GhMYB44和GhLBD18。亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)GhMYC3、GhMYB44和GhLBD18主要表達(dá)于細(xì)胞核。在GhMYB44和GhLBD18的啟動子中存在與GhMYC3結(jié)合的G-box(CACGTT)元件。酵母單雜交(Y1H)和電泳遷移率(EMSA)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了GhMYC3特異性地結(jié)合GhMYB44和GhLBD18啟動子中的G-box基序。另外,煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)GhMYC3以G-box依賴的方式激活GhLBD18的轉(zhuǎn)錄,抑制GhMYB44的轉(zhuǎn)錄。
GhMYC3直接結(jié)合并調(diào)控GhMYB44和GhLBD18的轉(zhuǎn)錄
(a) GhMYC3的結(jié)合序列在基因組上的分布。(b) GhMYC3的主要結(jié)合基序CA T/C GT T/G。(c) GhMYC3下游基因的GO富集分析。(d) GhMYB44和GhLBD18啟動子序列中包含G-box基序。(e) Y1H實(shí)驗(yàn)。(f) EMSA實(shí)驗(yàn)。(g-h) 煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)分析及LUC熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)。
3. GhMYB44與GhLBD18的啟動子直接相互作用,抑制其表達(dá)
DAP-seq分析發(fā)現(xiàn)在GhLBD18啟動子中存在MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。Y1H和EMSA實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了GhMYB44與GhLBD18啟動子的直接結(jié)合。瞬時(shí)基因表達(dá)分析表明GhMYB44通過直接結(jié)合GhLBD18的啟動子序列抑制其表達(dá)。以上結(jié)果表明,GhMYC3除了通過與GhLBD18啟動子特定位點(diǎn)結(jié)合直接激活GhLBD18的表達(dá)外,還通過GhMYB44-GhLBD18轉(zhuǎn)錄級聯(lián)信號間接調(diào)控GhLBD18的表達(dá)。
4. GhMYB44通過GhLBD18調(diào)控SE過程
利用OE-GhMYB44、SRDX-GhMYB44(特異性沉默系)和OEGhLBD18棉花株系進(jìn)一步研究MYB44調(diào)控SE的過程。與WT相比,在OE-GhMYB44中愈傷組織起始延緩,愈傷組織增殖減弱,EC分化加速;相反,在SRDX-GhMYB44和OE-GhLBD18中愈傷組織起始提前,愈傷組織增殖增強(qiáng),EC分化延遲。因此,GhMYB44在GhLBD18的上游發(fā)揮作用,在愈傷組織起始、愈傷細(xì)胞增殖和愈傷組織向EC的轉(zhuǎn)變過程中控制細(xì)胞命運(yùn)的決定。
5. GhRCD1與GhMYC3相互作用調(diào)節(jié)SE過程
采用酵母雙雜交(Y2H)鑒定到在SE過程中與GhMYC3互作的蛋白GhRCD1,該蛋白在愈傷組織和EC形成的不同階段均被誘導(dǎo),但在體細(xì)胞胚中保持較低水平。雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)實(shí)驗(yàn)、Pull down實(shí)驗(yàn)、LUC互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證明了GhMYC3與GhRCD1蛋白有相互作用。GhRCD1的敲除突變體(KO-GhRCD1)和過表達(dá)轉(zhuǎn)基因系(OE-GhRCD1)實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn),與WT相比KO-GhRCD1表現(xiàn)出愈傷組織起始提早,生長加快,F(xiàn)W增加;而與WT和KO-GhRCD1相比,OE-GhRCD1表現(xiàn)為愈傷組織起始延遲,增殖減少,EC分化率降低。結(jié)果表明,RCD1的適當(dāng)表達(dá)對SE過程至關(guān)重要,但RCD1的過表達(dá)或突變均不利于愈傷組織細(xì)胞的命運(yùn)轉(zhuǎn)變過程。
GhRCD1與GhMYC3有相互作用
(a) Y2H實(shí)驗(yàn)。(b) BiFC實(shí)驗(yàn)。(c) Pull down實(shí)驗(yàn)。(d) LUC互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)。(e-g) KO-GhRCD1和OE-GhRCD1在SE不同發(fā)育階段的形態(tài)學(xué)分析(e)、FW分析(f)和EC分化率分析(g)。
6. GhRCD1拮抗GhMYC3調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄能力
使用雙熒光素酶報(bào)告(Dual-luc)實(shí)驗(yàn)檢測GhRCD1是否影響GhMYC3對其下游靶點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。將LUC報(bào)告基因分別與GhMYB44和GhLBD18啟動子融合,再通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染測定啟動子活性。GhMYC3的過表達(dá)抑制了GhMYB44啟動子驅(qū)動的LUC表達(dá),但過表達(dá)GhRCD1削弱了這種抑制作用;GhMYC3增強(qiáng)了GhLBD18啟動子驅(qū)動的LUC表達(dá),而過表達(dá)GhRCD1削弱了這種增強(qiáng)作用。此外,GhMYB44能夠直接抑制GhLBD18的表達(dá),但GhMYB44和GhMYC3共表達(dá)導(dǎo)致GhLBD18啟動子驅(qū)動的LUC表達(dá)水平顯著高于單獨(dú)表達(dá)GhMYB44,這表明GhMYC3直接干擾了GhMYB44對GhLBD18的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。qRT-PCR檢測結(jié)果表明GhMYB44的表達(dá)水平與GhMYC3的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。GhLBD18在OE-GhMYC3和SRDX-GhMYB44中表達(dá)上調(diào),而在Ri-GhMYC3細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)??傊?,在SE過程中GhRCD1抑制GhMYC3對GhMYB44和GhLBD18的表達(dá)調(diào)控能力。
7. 由RCD1-MYC3-MYB44-LBD18級聯(lián)介導(dǎo)的活性氧穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變
利用ROS熒光探針H2DCF和BCIP-NBT檢測SE不同發(fā)育階段的ROS積累,發(fā)現(xiàn)ROS最初在外植體階段的損傷組織中增加,細(xì)胞內(nèi)ROS水平與愈傷組織細(xì)胞增殖呈正相關(guān),第21 d時(shí)在發(fā)育的愈傷組織中觀察到氧化爆發(fā)。在EC發(fā)育過程中,ROS在愈傷組織的胚性前區(qū)富集,但在其他部位枯竭。過表達(dá)GhMYC3和GhLBD18導(dǎo)致ROS積累,促進(jìn)愈傷組織細(xì)胞增殖,然而過表達(dá)GhMYB44則相反。最后,該研究提出了一個(gè)愈傷組織形成和SE的模型。在下胚軸外植體培養(yǎng)的不同發(fā)育階段,GhRCD1、GhMYC3、GhMYB44和GhLBD18的表達(dá)水平與細(xì)胞命運(yùn)決定和細(xì)胞分化動態(tài)緊密相關(guān)。這些基因的精確時(shí)空表達(dá)可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)ROS的積累,進(jìn)而影響SE過程中的細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變。
GhRCD1-GhMYC3-GhMYB44-GhLBD18信號級聯(lián)調(diào)控SE的機(jī)制模型圖
在愈傷組織誘導(dǎo)過程中,GhMYC3通過調(diào)控GhMYB44和GhLBD18的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)一步激活ROS依賴的信號通路,使ROS優(yōu)先在誘導(dǎo)部位積累,并在愈傷組織增殖過程中達(dá)到峰值。在EC獲得過程中,較高水平的GhRCD1可能抑制GhMYC3對GhMYB44和GhLBD18的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,從而相應(yīng)地減少ROS的積累,而且ROS在EC周圍呈極性分布。
本文小結(jié):該研究揭示了SE過程中細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。GhMYC3通過結(jié)合GhMYB44和GhLBD18啟動子中的G-box元件調(diào)節(jié)其表達(dá)。GhRCD1拮抗GhMYC3對下游靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控能力。GhRCD1-GhMYC3-GhMYB44-GhLBD18組成的轉(zhuǎn)錄級聯(lián)模塊呈現(xiàn)時(shí)序表達(dá)模式,并時(shí)序性的調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)ROS穩(wěn)態(tài),進(jìn)而影響SE過程中細(xì)胞的命運(yùn)。
參考文獻(xiàn):Yuan J, Liu X, Zhao H, Wang Y, Wei X, Wang P, Zhan J, Liu L, Li F, Ge X. GhRCD1 regulates cotton somatic embryogenesis by modulating the GhMYC3-GhMYB44-GhLBD18 transcriptional cascade. New Phytol. 2023. doi: 10.1111/nph.19120. (IF=10.323)
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